М.Н. Карагяур1, К.Д. Бозов2, А.Л. Примак3, С.С. Джауари4, М.Е. Илларионова5, П.С. Климович6, Е.В. Сёмина7, Л.М. Самоходская8, В.С. Попов9, Д.А. Шелег10, Е.А. Нейфельд11

1–11 ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (Москва, Россия)

1 m.karagyaur@mail.ru, 2 kir-bozov@yandex.ru, 3 primak.msu@mail.ru, 4 stalik.djauari@yandex.ru, 5 mar729i63illar90@yandex.ru, 6 lex2050@mail.ru, 7 e-tal@yandex.ru, 8 samokhodskay@gmail.com, 9 galiantus@gmail.com, 10 sheleg-da@mail.ru, 11 ea.neyfeld@mail.ru

Постановка проблемы. Идентификация и установление функциональной значимости геномных вариантов является одной из задач генетики человека. Для решения этой задачи в широкомасштабных рутинных исследованиях лучше всего подходит технология аллель-специфичной ПЦР, особенно в модификации ARMS. Проблемой является отсутствие понятных и доступных алгоритмов дизайна 3'-концов праймеров, обусловливающих специфичность и эффективность ARMS-анализа.

Цель работы – выработка алгоритма дизайна 3'-концов ARMS-праймеров для детекции однонуклеотидных геномных вариантов, а также разработка программного пакета для автоматизации процесса дизайна 3'-концов ARMS-праймеров.

Результаты. Разработан алгоритм дизайна 3’-концов внутренних ARMS-праймеров, который в свою очередь был использован для создания программы ARMS PrimerDesign. Разработанное программное обеспечение позволяет оптимизировать дизайн ARMS-праймеров вне зависимости от характера нуклеотидной замены, а также ориентации праймеров относительно целевого геномного варианта. С помощью программы ARMS PrimerDesign осуществлен дизайн праймеров для детекции геномных вариантов #rs4760 (ген PLAUR), #rs17445840 (ген CDH2), #rs28561984 (ген DCHS2), #rs10999947 (ген CDH23), ранее идентифицированных в образцах ДНК пациентов с психическими заболеваниями. Специфичность и эффективность полученных праймеров для ARMS-анализа была верифицирована путем сопоставления полученных результатов с результатами секвенирования по Сэнгеру. Установлено, что замена нуклеотида «-2» во внутренних праймерах увеличивает эффективность ARMS-анализа по сравнению с заменой нуклеотида «-1», но уменьшает специфичность ARMS в ряде случаев: некоторые гомозиготные варианты могут ошибочно интерпретироваться как гетерозиготные. Экспериментально было установлено, что оптимальная температура для проведения ARMS ПЦР может на 5…7 градусов быть выше теоретически предсказанной.

Практическая значимость. Полученные результаты подтверждают высокую специфичность и эффективность применения разновидности аллель-специфичной ПЦР, ARMS для рутинного определения искомых геномных вариантов на больших выборках. Оптимальной специфичности и эффективности ARMS можно добиться внесением нуклеотидных замен в положение «-1» на 3’-конце внутренних аллель-специфичных праймеров, в чем может помочь разработанная программа ARMS PrimerDesign, с последующим экспериментальным определением оптимальной температуры отжига тетраплекса подобранных праймеров.

Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Климович П.С., Сёмина Е.В., Самоходская Л.М.,
Попов В.С., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Оптимизация технологии аллель-специфичной ПЦР для детекции однонуклеотидных геномных вариантов // Технологии живых систем. 2025. T. 22. № 2. С. 37-48. DOI: https://doi.org/10.18127/j20700997-202502-04

1. Auton A., Brooks L.D., Durbin R.M. et al. A global reference for human genetic variation // Nature. 2015. V. 526. № 7571. P. 68–74. DOI: 10.1038/nature15393
2. Zeman M.K., Cimprich K.A. Causes and consequences of replication stress // Nat Cell Biol. 2014. V. 16. № 1. С. 2-9. DOI: 10.1038/ncb2897
3. Telenti A., Pierce L.C., Biggs W.H. et al. Deep sequencing of 10,000 human genomes // Proc Natl Acad Sci USA. 2016. V. 113. № 42. P. 11901-11906. DOI: 10.1073/pnas.1613365113
4. Zhang C., Gao Y., Ning Z. et al. PGG.SNV: understanding the evolutionary and medical implications of human single nucleotide variations in diverse populations // Genome Biol. 2019. V. 20. № 1. P. 215. DOI: 10.1186/s13059-019-1838-5
5. Wang Y., Li H., Hou L. et al. Genome-wide association study on coordination and agility in 461 Chinese Han males // Heliyon. 2023. V. 9. № 8. P. e19268. DOI: 10.1016/j.heliyon.2023.e19268
6. Weedon M.N., Jackson L., Harrison J. et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: retrospective, population based diagnostic evaluation // BMJ. 2021. V. 372. P. n214. DOI: 10.1136/bmj.n214
7. Horvat S., Bünger L. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay for the mouse leptin receptor (Lepr(db)) mutation // Lab Anim. 1999. V. 33. № 4. P. 380-384. DOI: 10.1258/002367799780487850
8. Old J.M., Varawalla N.Y., Weatherall D.J. Rapid detection and prenatal diagnosis of beta-thalassaemia: studies in Indian and Cypriot populations in the UK // Lancet. 1990. V. 336. № 8719. P. 834-837. DOI: 10.1016/0140-6736(90)92338-i
9. Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations // Curr Protoc Hum Genet. 2001. Ch. 9. Iss. 9.8. DOI: 10.1002/0471142905.hg0908s07
10. Chen J., Xu X., Dalhaimer P., Zhao L. Tetra-Primer Amplification-Refractory Mutation System (ARMS)-PCR for Genotyping Mouse Leptin Gene Mutation // Animals (Basel). 2022. V. 12. № 19. P. 2680. DOI: 10.3390/ani12192680
11. Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. 2017. V. 551. № 7681. P. 464-471. DOI: 10.1038/nature24644
12. Karagyaur M., Primak A., Bozov K. et al. Novel missense variants in brain morphogenic genes associated with depression and schizophrenia // Front Psychiatry. 2024. V. 15. P. 1338168. DOI: 10.3389/fpsyt.2024.1338168
13. Рысенкова К.Д., Семина Е.В., Карагяур М.Н. и др. Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 для подавления экспрессии гена урокиназного рецептора в клетках нейробластомы // Технологии живых систем. 2018. Т. 15. № 1. С. 10-19.
14. Muneeswarana K., de Silvac V.A., Dayabandarad M. et al. SNPgen: A portal of innovative automated tools for genotyping assay design // Software impacts. 2024. V. 21. P. 100684. DOI: 10.1016/j.simpa.2024.100684