М.Н. Карагяур1, А.Л. Примак2, А.Е. Толстолужинская3, А.В. Решетнев4, Н.А. Басалова5, С.С. Джауари6, К.Д. Бозов7, А.Н. Великанов8, А.Ю. Ефименко9, Е.В. Семина10, Л.М. Самоходская11, П.С. Климович12, В.С. Попов13, Д.А. Шелег14, Е.А. Нейфельд15

1–15 Медицинский научно-образовательный институт ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (Москва, Россия)

1 m.karagyaur@mail.ru, 2 primak.msu@mail.ru, 3 a.luzh@yandex.ru, 4 sasharesh@gmail.com, 5 natalia_ba@mail.ru, 6 stalik.djauari@yandex.ru, 7 kir-bozov@yandex.ru, 8 av-bioem@mail.ru, 9 efimenkoan@gmail.com, 10 e-tal@yandex.ru, 11 samokhodskay@gmail.com, 12 lex2050@mail.ru, 13 galiantus@gmail.com, 14 sheleg-da@mail.ru, 15 ea.neyfeld@mail.ru

Постановка проблемы. Большое разнообразие технологий генетической модификации клеточных культур сопряжено с необходимостью четкого понимания их потенциала и ограничений. Идентификация наиболее эффективных и точных из них позволит сэкономить исследователям время для получения искомых клеточных моделей.

Цель работы – сравнительный анализ потенциала технологий праймированного редактирования, редактирования оснований и транс-сплайсинга для моделирования искомых вариантов генов человека: ACTA2, ADRB2, ADRB3 и гена мыши Plaur.

Результаты. Установлено, что технология транс-сплайсинга обладает невысокой эффективностью и специфичностью. Данный подход очень чувствителен к дизайну донорной транс-РНК, оптимизация которой требует много времени и ресурсов для каждого конкретного случая. Праймированное редактирование обеспечивает относительно невысокую эффективность целевой модификации при значительно более высокой вероятности образования нецелевых продуктов. Технология редактирования оснований, напротив, позволяет модифицировать не менее 50 % от общего числа аллелей в клеточной популяции, при минимально выраженной нецелевой активности, что подтверждается результатами секвенирования по Сэнгеру и проточной цитометрии модифицированных клеток.

Практическая значимость. Полученные данные не позволяют рассматривать технологии транс-сплайсинга и праймированного редактирования как эффективные и специфичные подходы к моделированию искомых геномных вариантов. Наиболее эффективной, удобной и адаптированной для создания генетически модифицированных клеточных моделей является технология редактирования оснований, которая позволяет достигать приемлемого уровня редактирования даже в неклонированной клеточной популяции.

1. Vashishat A., Patel P., Das Gupta G., Das Kurmi B. Alternatives of Animal Models for Biomedical Research: a Comprehensive Review of Modern Approaches // Stem Cell Rev Rep. 2024. V. 20. №. 4. P. 881-899. DOI: 10.1007/s12015-024-10701-x
2. Duval K., Grover H., Han L.H. et al. Modeling Physiological Events in 2D vs 3D Cell Culture // Physiology (Bethesda). 2017. V. 32. № 4. P. 266-277. DOI: 10.1152/physiol.00036.2016
3. Li M., Izpisua Belmonte J.C. Organoids - Preclinical Models of Human Disease // N. Engl. J. Med. 2019. V. 380 №. 6. P. 569-579. DOI: 10.1056/NEJMra1806175
4. Weinstein-Marom H., Blokon-Kogan D., Levi-Mann M. et al. Genetic Modification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes, Peripheral T Cells, and T-Cell Model Cell Lines // Methods Mol. Biol. 2024. V. 2748. P. 167-186. DOI: 10.1007/978-1-0716-3593-3_13
5. Karagyaur M., Primak A., Efimenko A. et al. The Power of Gene Technologies: 1001 Ways to Create a Cell Model // Cells. V. 11. № 20. P. 3235. DOI: 10.3390/cells11203235
6. Fontes A., Lakshmipathy U. Advances in genetic modification of pluripotent stem cells // Biotechnol. Adv. 2013. V. 31. № 7. P. 994-1001. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2013.07.003
7. Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. 2017. V. 551. № 7681. P. 464-471. DOI: 10.1038/nature24644
8. Anzalone A.V., Randolph P.B., Davis J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. V. 576. № 7785. P. 149-157. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4
9. Lasda E.L., Blumenthal T. Trans-splicing // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. V. 2. № 3. P. 417-434. DOI: 10.1002/wrna.71
10. Chu V.T., Weber T., Wefers B. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. № 5. P. 543-548. DOI: 10.1038/nbt.3198
11. Cheng H., Zhang F., Ding Y. CRISPR/Cas9 Delivery System Engineering for Genome Editing in Therapeutic Applications // Pharmaceutics. 2021. V. 13. № 10. P. 1649. DOI: 10.3390/pharmaceutics13101649
12. Murphy W.J., Watkins K.P., Agabian N. Identification of a novel Y branch structure as an intermediate in trypanosome mRNA processing: evidence for trans splicing // Cell. 1986. V. 47. № 4. P. 517-525. DOI: 10.1016/0092-8674(86)90616-1
13. Zaphiropoulos P.G. Trans-splicing in Higher Eukaryotes: Implications for Cancer Development? // Front. Genet. 2011. V. 2. P. 92. DOI: 10.3389/fgene.2011.00092
14. Doi A., Delaney C., Tanner D. et al. RNA exon editing: Splicing the way to treat human diseases // Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2024. V. 35. № 3. P. 102311. DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102311
15. Palazzo A.F., Lee E.S. Sequence Determinants for Nuclear Retention and Cytoplasmic Export of mRNAs and lncRNAs // Front. Genet. 2018. V. 9. P. 440. DOI: 10.3389/fgene.2018.00440
16. Madsen C.D., Sidenius N. The interaction between urokinase receptor and vitronectin in cell adhesion and signalling // Eur. J. Cell Biol. 2008. V. 87. № 8-9. P. 617-629. DOI: 10.1016/j.ejcb.2008.02.003
17. Huang T.P., Zhao K.T., Miller S.M. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 6. P. 626-631. DOI: 10.1038/s41587-019-0134-y
18. Grünewald J., Zhou R., Iyer S. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 9. P. 1041-1048. DOI: 10.1038/s41587-019-0236-6
19. Primak A., Kalinina N., Skryabina M. et al. Novel Immortalized Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cell Line for Studying Hormonal Signaling // Int. J. Mol. Sci. 2024. V. 25. № 4. P. 2421. DOI: 10.3390/ijms25042421
20. Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI) // Methods Enzymol. 2013. V. 529. P. 227-240. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5
21. Tyurin-Kuzmin P.A., Karagyaur M.N., Kulebyakin K.Y. et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 12. P. 4442. DOI: 10.3390/ijms21124442
22. Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. P. 1399–1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w
23. Dyikanov D.T., Vasiluev P.A., Rysenkova K.D. et al. Optimization of CRISPR/Cas9 Technology to Knock Out Genes of Interest in Aneuploid Cell Lines // Tissue Eng. Part C Methods. 2019. V. 25. № 3. P. 168-175. DOI: 10.1089/ten.TEC.2018.0365
24. Карагяур М.Н., Дыйканов Д.Т., Ростовцева А.И., Кочегура Т.Н. Детекция событий модификации генома // Редактирование генов и геномов, 2-е изд. Новосибирск: Академгородок СО РАН. 2018. Т. 3. С. 87-116.
25. Schene I.F., Joore I.P., Baijens J.H.L. et al. Mutation-specific reporter for optimization and enrichment of prime editing // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 1028. DOI: 10.1038/s41467-022-28656-3
26. Berger A., Maire S., Gaillard M.C. et al. mRNA trans-splicing in gene therapy for genetic diseases. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 4. P. 487-498. DOI: 10.1002/wrna.1347
27. Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 7. P. 1399-1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w
28. Barthélémy F., Wein N. Personalized gene and cell therapy for Duchenne Muscular Dystrophy // Neuromuscul. Disord. 2018. V. 28. № 10. P. 803-824. DOI: 10.1016/j.nmd.2018.06.009
29. Рысенкова К.Д., Семина Е.В., Карагяур М.Н. и др. Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 для подавления экспрессии гена урокиназного рецептора в клетках нейробластомы // Технологии живых систем. 2018. Т. 15. № 1. С. 10-19.
30. Semina E., Rubina K., Sysoeva V. et al. Urokinase and urokinase receptor participate in regulation of neuronal migration, axon growth and branching // Eur. J .Cell Biol. 2016. V. 95. № 9. P. 295-310. DOI: 10.1016/j.ejcb.2016.05.003
31. Shmakova A., Balatskiy A., Kulebyakina M. et al. Urokinase Receptor uPAR Overexpression in Mouse Brain Stimulates the Migration of Neurons into the Cortex during Embryogenesis // Russian Journal of Developmental Biology. 2021. V. 52. № 1. P. 53-63. DOI: 10.1134/S1062360421010069
32. Yoon DE., Kim NR., Park S.J. et al. Precise base editing without unintended indels in human cells and mouse primary myoblasts // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 12. P. 2586-2595. DOI: 10.1038/s12276-023-01128-4