Хань Ци1, С.В. Иванов2, А.В. Смородинов3, Н.А. Ветрова4, А.Г. Гудков5

1,3,4 Инженерная академия РУДН (Москва, Россия)
2 МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, Россия)
2 ГБУЗ Клинико-диагностический центр № 4 ДЗМ филиал № 5 (Москва, Россия)
3,5 МГТУ им. Н.Э. Баумана (национальный исследовательский университет) (Москва, Россия)
5 ООО «НПИ ФИРМА «ГИПЕРИОН» (Москва, Россия)
1 hanqieric@126.com, 2 ivanov-stepa@yandex.ru, 3 a030720182057@gmail.com, 4 vetrova@bmstu.ru, 5 profgudkov@gmail.com

Постановка проблемы. Современные методы лабораторной медицинской диагностики требуют постоянного совершенствования для достижения высокой чувствительности и специфичности. Традиционные методы диагностики ограничены в своей способности обнаруживать низкие концентрации вирусов или различать разные штаммы. В настоящее время приобретает особую важность и актуальность необходимость разработки и внедрения новых технологий, способных значительно улучшить эффективность обнаружения вирусных инфекций и других патологических состояний, т.е. существует потребность в инновационных подходах, объединяющих силы современных биотехнологий, включая технологию CRISPR, и нанотехнологий, для разработки более эффективных методов медицинской диагностики.

Цель. Провести анализ применения технологии CRISPR и нанотехнологий для медицинской диагностики для улучшения чувствительности и специфичности методов обнаружения вирусных инфекций.

Результаты. В рамках исследования по применению технологии CRISPR и нанотехнологий в области медицинской диагностики разработана инновационная платформа, объединяющая преимущества обоих направлений. С помощью экспериментов продемонстрировано эффективное обнаружение вирусов при амплификации нуклеиновых кислот при использовании интегрированных микрофлюидных систем для более точной и быстрой диагностики. Показано, что применение наноматериалов в разработке биосенсоров позволило добиться высокой чувствительности к вирусам гриппа и SARS-CoV-2. Установлено, что эти инновационные методы имеют огромный потенциал в медицине и предоставляют новые возможности для более эффективного контроля и борьбы с инфекционными заболеваниями.

Практическая значимость. Результаты и разработанные методы могут быть успешно применены в лабораторной диагностике. Создание интегрированной платформы, объединяющей технологию CRISPR и нанотехнологические решения, предоставляет уникальные возможности для более точного и быстрого обнаружения вирусных инфекций, включая грипп и SARS-CoV-2. Применение наноматериалов для биосенсоров значительно повышает эффективность методов диагностики. Это важно для раннего выявления инфекций, особенно в условиях эпидемий и пандемий. Такие технологии позволят контролировать и предотвращать распространение вирусных заболеваний, что имеет высокую практическую значимость для здравоохранения и общества в целом.

Ци Хань, Иванов С.В., Смородинов А.В., Ветрова Н.А., Гудков А.Г. CRISPR и нанотехнологические решения для диагностических целей в медицинской практике // Нанотехнологии: разработка, применение – XXI век. 2023. Т. 15. № 4. С. 30–46. DOI: https://doi.org/ 10.18127/j22250980-202304-04

1. Коробкина Е.А., Князева М.С., Киль Ю.В. Сравнительный анализ методов детекции микроРНК с помощью метода обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) // Клиническая лабораторная диагностика. 2018. Т. 63. № 11. С. 722–728. DOI 10.18821/0869-2084-2018-63-11-722-728. – EDN YUGSTZ.
2. Келлнер М.Дж., Кооб Дж.Г., Гутенберг Дж.С., Абудайе О.О., Чжан Ф. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases // Nat Protoc. 2019 окт.; № 14(10). С. 2986–3012. DOI: 10.1038/s41596-019-0210-2. Epub сен 2019. Erratum in: Nat Protoc. 2020 мар; 15(3): 1311.
3. Чен Дж.С., Ма Э., Харрингтон Л.Б., Да Коста М., Тянь С., Палефски Дж.М., Даудна Дж.А. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity // Science. 2018 апр 27; № 360(6387). С. 436–439. DOI: 10.1126/ SCIENCE.AAR6245. Epub 2018 фев. 15. Erratum in: Science.
4. Танимото И., Мори А., Миямото С., Ито Э., Арикава К., Ивамото Т. Comparison of RT-PCR, RT-LAMP, and Antigen Quantification Assays for the Detection of SARS-CoV-2 // Jpn J Infect Dis. 2022 май 24; № 75(3). С. 249–253. DOI: 10.7883/ YOKEN.JJID.2021.476. Epub 2021 сен 30. PMID: 34588370.
5. Ван Ж., Ван Ж., Ли Р., Лю Л., Юань У. Rapid and sensitive detection of canine distemper virus by real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification // BMC Vet Res. 2017 авг. 15; № 13(1). С. 241. DOI: 10.1186/S12917-017-1180-7
6. Чжанг У., Пан Ц., Ли Ф., Чжу М., Су Г. Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification Coupled with CRISPR-Cas12a for Facile and Highly Sensitive Colorimetric SARS-CoV-2 Detection // Anal Chem. 2021 Mar 2; № 93(8). P. 4126–4133. DOI: 10.1021/acs.analchem
7. Канг Дж., Тахир А., Ван Х., Чанг Дж. Applications of nanotechnology in virus detection, tracking, and infection mechanisms // Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2021 июль; 13(4): e1700. DOI: 10.1002/WNAN.1700. Epub 2021 янв 28.
8. Дессале М., Менгисту Г., Менгист Х.М. Nanotechnology: A Promising Approach for Cancer Diagnosis, Therapeutics and Theragnosis // Int J Nanomedicine. 2022 авг. 26; № 17. С. 3735–3749. DOI: 10.2147/IJN.S378074
9. Хатчинсон Е.С. Influenza Virus. // Trends Microbiol. 2018 сен; № 26(9). С. 809–810. DOI: 10.1016/J.TIM.2018.05.013
10. Лоу М. Influenza virus entry // Adv Exp Med Biol. 2012; 726: 201–21. DOI: 10.1007/978-1-4614-0980-9_9
11. Фаруки Т., Малик Дж.А., Мулла А.Х., Аль Хагбани Т., Альмансур К., Убайд М.А., Альгамди С., Анвар С. An overview
    of SARS-COV-2 epidemiology, mutant variants, vaccines, and management strategies // J Infect Public Health. 2021 окт.; № 14(10). С. 1299–1312. DOI: 10.1016/J.JIPH
12. Вельбой Т.С, Литвина Л.А. Вирус гриппа – современная опасность для человека // Проблемы биологии, зоотехнии и биотехнологии: Сб. тр. научно-практ. конф. науч. об-ва студентов и аспирантов биолого-технолог. факультета. Новосибирск, 10–14 декабря 2018 г. Новосибирск: Издательский центр НГАУ «Золотой колос». 2019. С. 159–164. EDN YVDZDV.
13. Ху Б., Гуо Х., Чжоу П., Ши З.Л. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19 // Nat Rev Microbiol. 2021 мар; № 19(3).
    С. 141–154. DOI: 10.1038/S41579-020-00459-7. Epub 2020 окт 6. Erratum in: Nat Rev Microbiol.
14. Тернер С.А., Абу Шар Р., Янг З. The basics of commonly used molecular techniques for diagnosis, and application of molecular testing in cytology // Diagn Cytopathol. 2023 янв; № 51(1). С. 83–94. DOI: 10.1002/DC.25067
15. Хусанов Х.И., Шевкопляс Л.А. Сравнительный анализ SARS-COV-2, SARS-COV и MERS-COV // Инновации. Наука. Образование. 2020. № 21. С. 1597–1607. EDN YWYTNY.
16. Халикова Р.А., Садртдинов Д.А., Халикова А.А. Сравнительная характеристика данных при вспышке коронавируса SARS-COV-2 и SARS-COV // COVID-19 и Современное общество: Социально-экономические последствия и новые вызовы:
    Сб. ст. II Междунар. научно-практ. конф. Пенза, 7 сентября 2020 г. Пенза: «Наука и Просвещение» (ИП Гуляев Г.Ю.). 2020. С. 40–43. EDN NPZKBS.
17. Шехаб Ф.Ф. Molecular diagnostics: past, present, and future // Hum Mutat. 1993; № 2(5). С. 331–337. DOI: 10.1002/HUMU
18. Греуб Г., Сали Р., Бруйе Р., Жатон К. Ten years of R&D and full automation in molecular diagnosis // Future Microbiol. 2016.
    № 11(3). С. 403–425. DOI: 10.2217/FMB.15.152
19. Тендервелс К., Бернард П., Даниэль Э. Nanotechnology in Diagnosis: A Review // Advances in Nanoparticles. 2017. Т. 6. № 3.
20. Максимова Н.П., Анохина В.С., Гринев В.В. и др. Использование молекулярных и клеточных технологий для исследования геномов у микроорганизмов, растений и человека // Вестник БГУ. Сер. 2: Химия. Биология. География. 2011. № 3. С. 77–90. EDN SGWHZL.
21. Байда С., Адиль М., Туччинарди Т., Кордани М., Риццолио Ф. The History of Nanoscience and Nanotechnology: From Chemical-Physical Applications to Nanomedicine // Molecules. 2019 дек 27. № 25(1). С. 112. DOI: 10.3390/MOLECULES25010112
22. Абид Халим, Мохд Джавейд, Рави Пратап Сингх, Шанай Раб, Раджив Суман. Applications of nanotechnology in medical field: a brief review // Global Health Journal. 2023. DOI: 10.1016/J.GLOHJ.2023.02.008
23. Чжоу Х., Цоу Дж.Х., Чинталапалли М., Лю Х., Цзян Ф. Detection and Differentiation of SARS-CoV-2, Influenza, and Respiratory Syncytial Viruses by CRISPR // Diagnostics (Basel). 2021 мая 1. № 11(5). С. 823. DOI: 10.3390/DIAGNOSTICS11050823
24. Дзидзигури Э.Л., Сидорова Е.Н., Дзидзигури Э.Л., Сидорова Е.Н. Процессы получения наночастиц и наноматериалов. Нанотехнологии: учебное пособие. М.: Издательский дом МИСиС. 2012. 70 с.
25. Ельцов М.Ю. RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis. Автореферат дисс. … на соискание ученой степени кандидата биологических наук. СПб., 2004. 29 с.
26. Сионг Д., Дай У., Гонг Дж., Ли Г., Лю Н., У У., Пан Дж., Чен Ц., Цзяо И., Денг Х., Ие Дж., Чжанг И., Хуанг Х., Ли К.,
    Сюэ Л., Чжанг И., Тан Г. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a // PLoS Biol. 2020 дек 15. № 18(12). DOI: 10.1371/JOURNAL
27. Лю Ш., Ли Я., Уанг Дж., Сонг Ю., У Л., Ю Б., Ма Ш., Ма П., Лю Я., Хуанг И., Уанг Ш. Rapid and Specific Detection of Active SARS-CoV-2 With CRISPR/Cas12a // Front Microbiol. 2022 янв 28. № 12. DOI: 10.3389/FMICB.2022.820698
28. Сун И., Лю И., Лю Ч., Ие С., Чен В., Ли Д., Хуанг У. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a // J Transl Med. 2021 фев 16. № 19(1). DOI: 10.1186/S12967-021-02741-5
29. Динг И., Ин К., Ли З., Лалла Р.В., Баллестерос Е., Сфеир М.М., Лю Ч. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay // Nat Commun. 2020 сен 18. № 11(1). DOI: 10.1038/S41467-020-18575-6
30. Аман Р., Марсич Т., Сивакришна Рао Г., Махас А., Али З., Альсанеа М., Аль-Кахтани А., Альхамлан Ф., Махфуз М. iSCAN-V2: A One-Pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b Assay for Point-of-Care SARS-CoV-2 Detection // Front Bioeng Biotechnol. 2022 янв 21; № 9. DOI: 10.3389/FBIOE.2022.800104
31. Парк Б.Дж., Парк М.С., Ли Дж.М., Сонг И.Дж. Specific Detection of Influenza A and B Viruses by CRISPR-Cas12a-Based Assay // Biosensors (Basel). 2021 мар 19; № 11 (3). DOI: 10.3390/BIOS11030088
32. Гарсия-Вензор А., Руэда-Заразуа Б., Маркес-Гарсия Э., Мальдонадо В., Монкада-Моралес А., Оливера Х., Лопес И., Зуньига Х., Мелендес-Захгла Х. SARS-CoV-2 Direct Detection Without RNA Isolation With Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) and CRISPR-Cas12 // Front Med (Lausanne).
33. Чжан Т., Чжао В., Чэнь Ш. и др. Fully automated CRISPR-LAMP platform for SARS-CoV-2 Delta and Omicron variants // Аналитическая химия. 2022. Т. 94. Вып. 44. С. 15472–15480.
34. Али З., Аман Р., Махас А., Рао Г.С., Техсин М., Марсич Т., Салунке Р., Субуди Ак, Хала С.М., Хамдан С.М., Пейн А., Алофи Ф.С., Алсомали А., Хашем А.М., Хогир А., Алмонташири НАМ, Абедалтагафи М., Хасан Н., Махфуз М. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2 // Virus Res.2020 Oct 15; №288:198129. DOI: 10.1016/j.virusres.2020.198129
35. Ван Р., Цянь С., Пан Я., Ли М., Янг Я., Ма Х., Чжао М., Цянь Ф., Ю Х., Лю Чж., Ни Т., Чжэн И., Уанг И. opvCRISPR: One-pot visual RT-LAMP-CRISPR platform for SARS-cov-2 detection // Biosens Bioelectron. 2021 Jan 15; № 172:112766. DOI: 10.1016/j.bios.2020.112766
36. Чэн И., Ши И., Чэн И., Янг З., У Х., Чжоу З., Ли Ц., Пинг Ц., Хэ Л., Шэнь Х., Чэнь Ц., У Ц., Ю Я., Чжан И., Чэнь Х. Contamination-free visual detection of SARS-CoV-2 with CRISPR/Cas12a: A promising method in the point-of-care detection // Biosens Bioelectron. 2020 Dec 1; № 169:112642. DOI: 10.1016/j.bios
37. У Л., Уанг И., У В., Сю И., Лю И., Цао И., Танг И., Хуанг Т., Хуанг И. MnO2 Nanozyme-Mediated CRISPR-Cas12a System for the Detection of SARS-CoV-2 // ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Nov 16; № 14 (45). P. 50534–50542. DOI: 10.1021/ acsami.2c14497
38. Танг Д., Чжанг Ч., Тан В., Лонг Ф., Сун Ж., Ли И., Зоу С., Янг И., Цай К., Ли С., Ванг З., Лю И., Мао Г., Ма Я., Жао ГП., Тянь Г., Жао В. RT-RPA-Cas12a-based assay facilitates the discrimination of SARS-CoV-2 variants of concern // Sens Actuators B Chem. 2023 Apr 15; № 381:133433. DOI: 10.1016/j.snb.2023.133433
39. Чжан Я., Чен М., Лю И., Чжен Ц., Луо С., Сюэ И., Лян Ц., Чжоу Л., Тао И., Ли М., Ванг Д., Чжоу Ж., Ванг Д. Sensitive and rapid on-site detection of SARS-CoV-2 using a gold nanoparticle-based high-throughput platform coupled with CRISPR/Cas12-assisted RT-LAMP // Sens Actuators B Chem. 2021 Oct 15; № 345:130411. DOI: 10.1016/j.snb.2021.130411. Epub 2021 Jul 6
40. Цао И., У Цзинь, Панг Б., Чжан Х., Ле Х.С. CRISPR/Cas12a-mediated gold nanoparticle aggregation for colorimetric detection of SARS-CoV-2 // Chem Commun (Camb). 2021 Jul 13; № 57 (56). P. 6871–6874. DOI: 10.1039/d1cc02546e
41. Лю Л., Сю Чж., Авайда К., Доллери С.Дж., Бао М., Фан Ж., Кормье Д., О'Коннелл М., Тобин Дж., Дю К. Gold nanoparticle-labeled CRISPR-Cas13a assay for sensitive molecular counting in solid-state nanopores // Adv Mater Technol. 2022 Mar; № 7 (3): 2101550. DOI: 10.1002/admt.202101550
42. Лю Ш., Си Т., Пэй С., Ли С., Хэ И., Тонг И., Лю Г. CRISPR-Cas12a in combination with universal gold nanorod-mediated display probes for rapid and sensitive visual detection of SARS-CoV-2 // Sens Actuators B Chem. 2023 Feb 15;377:133009. DOI: 10.1016/j.snb.2022.133009. Epub 2022 Nov 22
43. Ли Дж., О Б., Чхои Дж. Development of a HIV-1 Virus Detection System Based on Nanotechnology // Sensors (Basel). 2015 Apr 27; №15 (5). P. 9915–27. DOI: 10.3390/s150509915
44. Мозгхани С.Х., Кермани Х.А., Норузи М., Араби М., Солтани С. Nanotechnology based strategies for HIV-1 and HTLV-1 retroviruses gene detection // Heliyon. 2020 May 27; № 6 (5) e04048. DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e04048
45. Дуан Л., Ван Я., Ли С.С., Ван З., Жай Ж. Rapid and simultaneous detection of human hepatitis B virus and hepatitis C virus antibodies based on a protein chip assay using nano-gold immunological amplification and silver staining method // BMC Infect Dis. 2005 Jul 6; № 5. С. 53. DOI: 10.1186/1471-2334-5-53
46. Негахдари Б., Дарвиши М., Саиди А.А. Gold nanoparticles and hepatitis B virus // Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec; № 47 (1). С. 455–461. DOI: 10.1080/21691401.2018.1553786. PMID: 30836779
47. Шоуки С.М., Бальд Д., Аззази Х.М. Direct detection of unamplified hepatitis C virus RNA using unmodified gold nanoparticles // Clin Biochem. 2010 Sep; № 43(13–14). С. 1163-8. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2010.07.001. Epub 2010 Aug 1
48. Чжанг Б., Пински Б.А., Ананта Дж.С., Чжао С., Арулкумар С., Уан Х., Саху М.К., Абейнайаке Дж., Уэггонер Дж.Дж., Хопс К., Танг М., Дай Х. Diagnosis of Zika virus infection on a nanotechnology platform // Nat Med. 2017 май; Т. 23 (5).
    С. 548–550. DOI: 10.1038/nm.4302
49. Вирийачайпорн Н., Сирикаев С., Бамрунгсап С., Лимчароен Т., Полканкосит П., Руксрангруанг П., Понламуанди К. A simple fluorescence-based lateral flow test platform for rapid influenza B virus screening // Anal Methods. 2021 апр 14; Т. 13 (14).
    С. 1687–1694. DOI: 10.1039/d0ay01988g
50. Хунг Л.И., Хуанг Т.Б., Цай Я.Ц., Е ЧС, Лей Х.И., Ли Г.Б. A microfluidic immunomagnetic bead-based system for the rapid detection of influenza infections: from purified virus particles to clinical specimens // Biomed Microdevices. 2013 июнь; Т. 15(3). С. 539–551. DOI: 10.1007/s10544-013-9753-0
51. Пунтил В., Нагеш П.Т., Хусейн М., Головко В.Б., Фэрбэнкс А.Дж. Gold Nanoparticles Decorated with Sialic Acid Terminated Bi-antennary N-Glycans for the Detection of Influenza Virus at Nanomolar Concentrations // ChemistryOpen. 2015 июль 14;
    Т. 4(6). С. 708–716. DOI: 10.1002/open.201500109
52. Ахмед С.Р., Ким Дж., Судзуки Т., Ли Дж., Парк И.И. Detection of influenza virus using peroxidase-mimic of gold nanoparticles // Biotechnol Bioeng. 2016 октябрь; Т. 113(10). С. 2298–2303. DOI: 10.1002/bit.25982
53. Фарре К., Виэцци С., Райт А., Робин П., Лежаль Н., Манцано М., Видич Дж., Шаикс С. Specific and sensitive detection of Influenza A virus using a biotin-coated nanoparticle enhanced immunomagnetic assay // Anal Bioanal Chem. 2022 январь;
    Т. 414(1). С. 265–276. DOI: 10.1007/s00216-020-03081-x
54. Джорданашвили С., Метревели Т., Клдиашвили Е. The detection of IgG class antibodies against SARS-CoV-2 nucleocapsid protein by application of nanoparticles // Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2023 февраль; Т. 27(3). С. 1203–1206. DOI: 10.26355/ eurrev_202302_31227
55. Госслен Б., Ретут М., Дутур Р., Троиан-Готье Л., Бевернаж Р., Эренс С., Лефевр П., Дени О., Брюлан Г., Жабен И. Ultrastable Silver Nanoparticles for Rapid Serology Detection of Anti-SARS-CoV-2 Immunoglobulins G // Anal Chem. 2022
    май 24; Т. 94(20): 7383–7390. DOI: 10.1021/acs.analchem.2c00870
56. Лянг П., Гуо К., Чжао Т., Уэн С., Тянь Чж., Шан Я., Синг Я., Цзэн Я. Ag Nanoparticles with Ultrathin Au Shell-Based Lateral Flow Immunoassay for Colorimetric and SERS Dual-Mode Detection of SARS-CoV-2 IgG // Anal Chem. 2022 июнь 14; Т. 94(23): 8466–8473. DOI: 10.1021/acs.analchem.2c01286
57. Имани Гешлагчаи, С. Мадани, Голчинфар. Development of a Nano-ELISA system for the rapid and sensitive detection of H9N2 avian influenza
58. Ван М., Фу А., Ху Б., Тонг И., Лю Р., Лю Ч., Гу Дж., Сян Б., Лю Чж., Цзянг У., Шен Г., Чжао У., Мэн Д., Дэнг З., Ю Л., Вэй У., Ли И., Лю Т. Nanopore Targeted Sequencing for the Accurate and Comprehensive Detection of SARS-CoV-2 and Other Respiratory Viruses // Small. 2020 Aug; № 16(32):e2002169. DOI: 10.1002/smll.202002169
59. Lee J.-H., Oh B.-K., Choi J.-W. Development of a HIV-1 Virus Detection System Based on Nanotechnology // Sensors. 2015. 15. 9915–9927. DOI: 10.3390/s150509915
60. Hussein H.A., Hanora A., Solyman S.M. et al. Designing and fabrication of electrochemical nano-biosensor for the fast detection of SARS-CoV-2-RNA // Sci Rep. 2023 Mar 29. № 13(1):5139. DOI: 10.1038/s41598-023-32168-5
61. Yudum Tepeli Büyüksünetçi, Ülkü Anık. Electro-Nano Diagnostic Platform Based on Antibody-Antigen Interaction: An Electrochemical Immunosensor for Influenza A Virus Detection // Biosensors. 2023. № 13(2). C. 176.