Сравнительный анализ потенциала технологий геномного редактирования и транс-сплайсинга для моделирования искомых геномных вариантов

М.Н. Карагяур; А.Л. Примак; А.Е. Толстолужинская; А.В. Решетнев; Н.А. Басалова; С.С. Джауари; К.Д. Бозов; А.Н. Великанов; А.Ю. Ефименко; Е.В. Семина; Л.М. Самоходская; П.С. Климович; В.С. Попов; Д.А. Шелег; Е.А. Нейфельд

doi:10.18127/j20700997-202501-05

Сравнительный анализ потенциала технологий геномного редактирования и транс-сплайсинга для моделирования искомых геномных вариантов

М.Н. Карагяур¹, А.Л. Примак², А.Е. Толстолужинская³, А.В. Решетнев⁴, Н.А. Басалова⁵, С.С. Джауари⁶, К.Д. Бозов⁷, А.Н. Великанов⁸, А.Ю. Ефименко⁹, Е.В. Семина¹⁰, Л.М. Самоходская¹¹, П.С. Климович¹², В.С. Попов¹³, Д.А. Шелег¹⁴, Е.А. Нейфельд¹⁵

научная статья УДК 577.29 Страницы: 60-78 doi.org/10.18127/j20700997-202501-05

^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15} Медицинский научно-образовательный институт ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (Москва, Россия)

Ключевые слова: Клеточные модели генетическая модификация транс-сплайсинг праймированное редактирование редактирование оснований

Аннотация

Постановка проблемы. Большое разнообразие технологий генетической модификации клеточных культур сопряжено с необходимостью четкого понимания их потенциала и ограничений. Идентификация наиболее эффективных и точных из них позволит сэкономить исследователям время для получения искомых клеточных моделей.

Цель работы – сравнительный анализ потенциала технологий праймированного редактирования, редактирования оснований и транс-сплайсинга для моделирования искомых вариантов генов человека: ACTA2, ADRB2, ADRB3 и гена мыши Plaur.

Результаты. Установлено, что технология транс-сплайсинга обладает невысокой эффективностью и специфичностью. Данный подход очень чувствителен к дизайну донорной транс-РНК, оптимизация которой требует много времени и ресурсов для каждого конкретного случая. Праймированное редактирование обеспечивает относительно невысокую эффективность целевой модификации при значительно более высокой вероятности образования нецелевых продуктов. Технология редактирования оснований, напротив, позволяет модифицировать не менее 50 % от общего числа аллелей в клеточной популяции, при минимально выраженной нецелевой активности, что подтверждается результатами секвенирования по Сэнгеру и проточной цитометрии модифицированных клеток.

Практическая значимость. Полученные данные не позволяют рассматривать технологии транс-сплайсинга и праймированного редактирования как эффективные и специфичные подходы к моделированию искомых геномных вариантов. Наиболее эффективной, удобной и адаптированной для создания генетически модифицированных клеточных моделей является технология редактирования оснований, которая позволяет достигать приемлемого уровня редактирования даже в неклонированной клеточной популяции.

Поступила: 19.11.2024
Одобрена: 20.11.2024
Принята: 14.02.2025

Для цитирования

Карагяур М.Н., Примак А.Л., Толстолужинская А.Е., Решетнев А.В., Басалова Н.А., Джауари С.С., Бозов К.Д., Великанов А.Н., Ефименко А.Ю., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Сравнительный анализ потенциала технологий геномного редактирования и транс-сплайсинга для моделирования искомых геномных вариантов // Технологии живых систем. 2025. № 1. С. 60–78. DOI: https://doi.org/10.18127/j20700997-202501-05

Список источников

Vashishat A., Patel P., Das Gupta G., Das Kurmi B. Alternatives of Animal Models for Biomedical Research: a Comprehensive Review of Modern Approaches // Stem Cell Rev Rep. 2024. V. 20. №. 4. P. 881-899. DOI: 10.1007/s12015-024-10701-x
Duval K., Grover H., Han L.H. et al. Modeling Physiological Events in 2D vs 3D Cell Culture // Physiology (Bethesda). 2017. V. 32. № 4. P. 266-277. DOI: 10.1152/physiol.00036.2016
Li M., Izpisua Belmonte J.C. Organoids - Preclinical Models of Human Disease // N. Engl. J. Med. 2019. V. 380 №. 6. P. 569-579. DOI: 10.1056/NEJMra1806175
Weinstein-Marom H., Blokon-Kogan D., Levi-Mann M. et al. Genetic Modification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes, Peripheral T Cells, and T-Cell Model Cell Lines // Methods Mol. Biol. 2024. V. 2748. P. 167-186. DOI: 10.1007/978-1-0716-3593-3_13
Karagyaur M., Primak A., Efimenko A. et al. The Power of Gene Technologies: 1001 Ways to Create a Cell Model // Cells. V. 11. № 20. P. 3235. DOI: 10.3390/cells11203235
Fontes A., Lakshmipathy U. Advances in genetic modification of pluripotent stem cells // Biotechnol. Adv. 2013. V. 31. № 7. P. 994-1001. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2013.07.003
Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. 2017. V. 551. № 7681. P. 464-471. DOI: 10.1038/nature24644
Anzalone A.V., Randolph P.B., Davis J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. V. 576. № 7785. P. 149-157. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4
Lasda E.L., Blumenthal T. Trans-splicing // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. V. 2. № 3. P. 417-434. DOI: 10.1002/wrna.71
Chu V.T., Weber T., Wefers B. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. № 5. P. 543-548. DOI: 10.1038/nbt.3198
Cheng H., Zhang F., Ding Y. CRISPR/Cas9 Delivery System Engineering for Genome Editing in Therapeutic Applications // Pharmaceutics. 2021. V. 13. № 10. P. 1649. DOI: 10.3390/pharmaceutics13101649
Murphy W.J., Watkins K.P., Agabian N. Identification of a novel Y branch structure as an intermediate in trypanosome mRNA processing: evidence for trans splicing // Cell. 1986. V. 47. № 4. P. 517-525. DOI: 10.1016/0092-8674(86)90616-1
Zaphiropoulos P.G. Trans-splicing in Higher Eukaryotes: Implications for Cancer Development? // Front. Genet. 2011. V. 2. P. 92. DOI: 10.3389/fgene.2011.00092
Doi A., Delaney C., Tanner D. et al. RNA exon editing: Splicing the way to treat human diseases // Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2024. V. 35. № 3. P. 102311. DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102311
Palazzo A.F., Lee E.S. Sequence Determinants for Nuclear Retention and Cytoplasmic Export of mRNAs and lncRNAs // Front. Genet. 2018. V. 9. P. 440. DOI: 10.3389/fgene.2018.00440
Madsen C.D., Sidenius N. The interaction between urokinase receptor and vitronectin in cell adhesion and signalling // Eur. J. Cell Biol. 2008. V. 87. № 8-9. P. 617-629. DOI: 10.1016/j.ejcb.2008.02.003
Huang T.P., Zhao K.T., Miller S.M. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 6. P. 626-631. DOI: 10.1038/s41587-019-0134-y
Grünewald J., Zhou R., Iyer S. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 9. P. 1041-1048. DOI: 10.1038/s41587-019-0236-6
Primak A., Kalinina N., Skryabina M. et al. Novel Immortalized Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cell Line for Studying Hormonal Signaling // Int. J. Mol. Sci. 2024. V. 25. № 4. P. 2421. DOI: 10.3390/ijms25042421
Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI) // Methods Enzymol. 2013. V. 529. P. 227-240. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5
Tyurin-Kuzmin P.A., Karagyaur M.N., Kulebyakin K.Y. et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 12. P. 4442. DOI: 10.3390/ijms21124442
Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. P. 1399–1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w
Dyikanov D.T., Vasiluev P.A., Rysenkova K.D. et al. Optimization of CRISPR/Cas9 Technology to Knock Out Genes of Interest in Aneuploid Cell Lines // Tissue Eng. Part C Methods. 2019. V. 25. № 3. P. 168-175. DOI: 10.1089/ten.TEC.2018.0365
Карагяур М.Н., Дыйканов Д.Т., Ростовцева А.И., Кочегура Т.Н. Детекция событий модификации генома // Редактирование генов и геномов, 2-е изд. Новосибирск: Академгородок СО РАН. 2018. Т. 3. С. 87-116.
Schene I.F., Joore I.P., Baijens J.H.L. et al. Mutation-specific reporter for optimization and enrichment of prime editing // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 1028. DOI: 10.1038/s41467-022-28656-3
Berger A., Maire S., Gaillard M.C. et al. mRNA trans-splicing in gene therapy for genetic diseases. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 4. P. 487-498. DOI: 10.1002/wrna.1347
Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 7. P. 1399-1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w
Barthélémy F., Wein N. Personalized gene and cell therapy for Duchenne Muscular Dystrophy // Neuromuscul. Disord. 2018. V. 28. № 10. P. 803-824. DOI: 10.1016/j.nmd.2018.06.009
Рысенкова К.Д., Семина Е.В., Карагяур М.Н. и др. Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 для подавления экспрессии гена урокиназного рецептора в клетках нейробластомы // Технологии живых систем. 2018. Т. 15. № 1. С. 10-19.
Semina E., Rubina K., Sysoeva V. et al. Urokinase and urokinase receptor participate in regulation of neuronal migration, axon growth and branching // Eur. J .Cell Biol. 2016. V. 95. № 9. P. 295-310. DOI: 10.1016/j.ejcb.2016.05.003
Shmakova A., Balatskiy A., Kulebyakina M. et al. Urokinase Receptor uPAR Overexpression in Mouse Brain Stimulates the Migration of Neurons into the Cortex during Embryogenesis // Russian Journal of Developmental Biology. 2021. V. 52. № 1. P. 53-63. DOI: 10.1134/S1062360421010069
Yoon DE., Kim NR., Park S.J. et al. Precise base editing without unintended indels in human cells and mouse primary myoblasts // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 12. P. 2586-2595. DOI: 10.1038/s12276-023-01128-4

[1] Vashishat A., Patel P., Das Gupta G., Das Kurmi B. Alternatives of Animal Models for Biomedical Research: a Comprehensive Review of Modern Approaches // Stem Cell Rev Rep. 2024. V. 20. №. 4. P. 881-899. DOI: 10.1007/s12015-024-10701-x

[2] Duval K., Grover H., Han L.H. et al. Modeling Physiological Events in 2D vs 3D Cell Culture // Physiology (Bethesda). 2017. V. 32. № 4. P. 266-277. DOI: 10.1152/physiol.00036.2016

[3] Li M., Izpisua Belmonte J.C. Organoids - Preclinical Models of Human Disease // N. Engl. J. Med. 2019. V. 380 №. 6. P. 569-579. DOI: 10.1056/NEJMra1806175

[4] Weinstein-Marom H., Blokon-Kogan D., Levi-Mann M. et al. Genetic Modification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes, Peripheral T Cells, and T-Cell Model Cell Lines // Methods Mol. Biol. 2024. V. 2748. P. 167-186. DOI: 10.1007/978-1-0716-3593-3_13

[5] Karagyaur M., Primak A., Efimenko A. et al. The Power of Gene Technologies: 1001 Ways to Create a Cell Model // Cells. V. 11. № 20. P. 3235. DOI: 10.3390/cells11203235

[6] Fontes A., Lakshmipathy U. Advances in genetic modification of pluripotent stem cells // Biotechnol. Adv. 2013. V. 31. № 7. P. 994-1001. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2013.07.003

[7] Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. 2017. V. 551. № 7681. P. 464-471. DOI: 10.1038/nature24644

[8] Anzalone A.V., Randolph P.B., Davis J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. V. 576. № 7785. P. 149-157. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4

[9] Lasda E.L., Blumenthal T. Trans-splicing // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. V. 2. № 3. P. 417-434. DOI: 10.1002/wrna.71

[10] Chu V.T., Weber T., Wefers B. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. № 5. P. 543-548. DOI: 10.1038/nbt.3198

[11] Cheng H., Zhang F., Ding Y. CRISPR/Cas9 Delivery System Engineering for Genome Editing in Therapeutic Applications // Pharmaceutics. 2021. V. 13. № 10. P. 1649. DOI: 10.3390/pharmaceutics13101649

[12] Murphy W.J., Watkins K.P., Agabian N. Identification of a novel Y branch structure as an intermediate in trypanosome mRNA processing: evidence for trans splicing // Cell. 1986. V. 47. № 4. P. 517-525. DOI: 10.1016/0092-8674(86)90616-1

[13] Zaphiropoulos P.G. Trans-splicing in Higher Eukaryotes: Implications for Cancer Development? // Front. Genet. 2011. V. 2. P. 92. DOI: 10.3389/fgene.2011.00092

[14] Doi A., Delaney C., Tanner D. et al. RNA exon editing: Splicing the way to treat human diseases // Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2024. V. 35. № 3. P. 102311. DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102311

[15] Palazzo A.F., Lee E.S. Sequence Determinants for Nuclear Retention and Cytoplasmic Export of mRNAs and lncRNAs // Front. Genet. 2018. V. 9. P. 440. DOI: 10.3389/fgene.2018.00440

[16] Madsen C.D., Sidenius N. The interaction between urokinase receptor and vitronectin in cell adhesion and signalling // Eur. J. Cell Biol. 2008. V. 87. № 8-9. P. 617-629. DOI: 10.1016/j.ejcb.2008.02.003

[17] Huang T.P., Zhao K.T., Miller S.M. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 6. P. 626-631. DOI: 10.1038/s41587-019-0134-y

[18] Grünewald J., Zhou R., Iyer S. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities // Nat. Biotechnol. 2019. V. 37. № 9. P. 1041-1048. DOI: 10.1038/s41587-019-0236-6

[19] Primak A., Kalinina N., Skryabina M. et al. Novel Immortalized Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cell Line for Studying Hormonal Signaling // Int. J. Mol. Sci. 2024. V. 25. № 4. P. 2421. DOI: 10.3390/ijms25042421

[20] Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI) // Methods Enzymol. 2013. V. 529. P. 227-240. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5

[21] Tyurin-Kuzmin P.A., Karagyaur M.N., Kulebyakin K.Y. et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 12. P. 4442. DOI: 10.3390/ijms21124442

[22] Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. P. 1399–1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w

[23] Dyikanov D.T., Vasiluev P.A., Rysenkova K.D. et al. Optimization of CRISPR/Cas9 Technology to Knock Out Genes of Interest in Aneuploid Cell Lines // Tissue Eng. Part C Methods. 2019. V. 25. № 3. P. 168-175. DOI: 10.1089/ten.TEC.2018.0365

[24] Карагяур М.Н., Дыйканов Д.Т., Ростовцева А.И., Кочегура Т.Н. Детекция событий модификации генома // Редактирование генов и геномов, 2-е изд. Новосибирск: Академгородок СО РАН. 2018. Т. 3. С. 87-116.

[25] Schene I.F., Joore I.P., Baijens J.H.L. et al. Mutation-specific reporter for optimization and enrichment of prime editing // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 1028. DOI: 10.1038/s41467-022-28656-3

[26] Berger A., Maire S., Gaillard M.C. et al. mRNA trans-splicing in gene therapy for genetic diseases. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 4. P. 487-498. DOI: 10.1002/wrna.1347

[27] Basalova N., Arbatskiy M., Popov V. et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 7. P. 1399-1412. DOI: 10.1038/s12276-023-01017-w

[28] Barthélémy F., Wein N. Personalized gene and cell therapy for Duchenne Muscular Dystrophy // Neuromuscul. Disord. 2018. V. 28. № 10. P. 803-824. DOI: 10.1016/j.nmd.2018.06.009

[29] Рысенкова К.Д., Семина Е.В., Карагяур М.Н. и др. Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 для подавления экспрессии гена урокиназного рецептора в клетках нейробластомы // Технологии живых систем. 2018. Т. 15. № 1. С. 10-19.

[30] Semina E., Rubina K., Sysoeva V. et al. Urokinase and urokinase receptor participate in regulation of neuronal migration, axon growth and branching // Eur. J .Cell Biol. 2016. V. 95. № 9. P. 295-310. DOI: 10.1016/j.ejcb.2016.05.003

[31] Shmakova A., Balatskiy A., Kulebyakina M. et al. Urokinase Receptor uPAR Overexpression in Mouse Brain Stimulates the Migration of Neurons into the Cortex during Embryogenesis // Russian Journal of Developmental Biology. 2021. V. 52. № 1. P. 53-63. DOI: 10.1134/S1062360421010069

[32] Yoon DE., Kim NR., Park S.J. et al. Precise base editing without unintended indels in human cells and mouse primary myoblasts // Exp. Mol. Med. 2023. V. 55. № 12. P. 2586-2595. DOI: 10.1038/s12276-023-01128-4