Е.И. Антонова1, А.Б. Ачилов2, Н.В. Фирсова3, Д.А. Викторов4, П.С. Торутанов5, Н.А. Ленгесова6

1–6 Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова» (г. Ульяновск, Россия)

1 antonov_67@mail.ru, 2 a.achilow@inbox.ru, 3 n-firsova@mail.ru, 4 viktorov.da@gmail.com, 5 pavel.toru2012@yandex.ru, 6 lengesova@yandex.ru

Постановка проблемы. Выделение природного химозина сопряжено с этическими проблемами и высокими экономическими затратами. Его генно-инженерные аналоги заменили натуральный, используя рекомбинантные технологии в микроорганизмах. Верблюжий химозин является более многообещающим, так как обладает более высокой термостабильностью и активностью свертывания молока, что делает его привлекательным для коммерческого производства сыра.

Цель работы – очистка и анализ ферментативной активности рекомбинантного химозина Camelus dromedarius (rChn-Cam), полученного в экспрессионной системе P. рastoris.

Результаты. Исследование по синтезу, очистке и анализу ферментативных свойств rChn-Cam Camelus dromedarius в экспрессионной системе P. рastoris выявило, что штаммы-продуценты P. pastoris GS115/his4 до и после трансформации челночной плазмидой pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT с промотором AOXI, фенотипа Mut+ целесообразнее наращивать, независимо от состава питательной среды, с дополнительным внесением 0,5% метанола в качестве источника углерода. При выращивании в обогащенной среде YPD (биотин 0,00004% и 1% глицерина) оптимальная концентрация зеоцина составляет 50 мкг/мл. Очистка рекомбинантных His-Tag – меченного химозина на Ni-NTA сефарозе (металл-аффинная хроматография), с проведением SDS-PAGE, Western-blot и иммунохимическим анализом позволили выявить его наличие на MALDI-TOF времяпролетном масс-спектрометре серии FLEX (MALDI-TOF MS) с применением панели MALDI BioTyper, масса которого составила 35,673 kDa. При повышении рН субстрата с 5,0 до 6,5 коагуляционная активность rChn-Cam снижалась на 24%, порог термической инактивации составил 40-45 °C. Единица активности свертываемости rChn-Cam снижается при увеличении концентрации зеоцина (50, 100, 200 мкг/мл); отмечена противоположная зависимость концентрации rChn-Cam от времени начала свертывания субстрата.

Практическая значимость. Представленные данные позволят в практической деятельности оптимизировать получение высокопродуктивного штамма-продуцента P.рastoris для дальнейшего высокого выхода rChn-Cam, что является хорошей альтернативой rChn, которые в настоящее время используются в промышленности по производству сыров.

Антонова Е.И., Ачилов А.Б., Фирсова Н.В., Викторов Д.А., Торутанов П.С., Ленгесова Н.А. Микробиологический синтез, очистка и ферментативные свойства рекомбинантного химозина Camelus dromedarius в экспрессионной системе Pichia pastoris // Технологии живых систем. 2025. T. 22. № 1. С. 87-98. DOI: https://doi.org/10.18127/j20700997-202501-07

1. Malik A., Gupta A., Dahiya S. et al. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins // The Pharma Innovation Journal. 2021. № 10 (11). P. 550-556.
2. Akishev Z., Aktayeva S., Kiribayeva A. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk // Biology. 2022. № 11. Р. e1545.
3. Антонова Е.И., Аббязова А.Н., Фирсова Н.В. и др. Генетические конструкции как источник получения рекомбинантного химозина // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии. Материалы VII Всеросс. научно-практ. конференции с междунар. участием, Ульяновск, 2024 г. / Под ред. Е. И. Антоновой. Чебоксары: Изд-во «Среда». 2024. С. 49-55.
4. Balabova D.V., Rudometov A.P., Belenkaya S.V. Biochemical and technological properties of moose (Alces alces) recombinant chymosin // Vavilovskii Zhurnal Genet. (Vavilov. J. Genet. Breed.). 2022. V. 26. P. 240-249.
5. da Silva R.R., Souto T.B., Gonsales da Rosa N. et al. Evaluation of the milk clotting properties of an aspartic peptidase secreted by Rhizopus microspores // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2020. V. 50. P. 226-233.
6. Balabova D.V., Belash E.A., Belenkaya S.V. et al. Biochemical properties of a promising milk-clotting enzyme, Moose (Alces alces) recombinant chymosin // Foods. 2023. № 12 (20). P. e3772. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37893665/
7. Fox P.F., Guinee T.P., Cogan T.M. et al. Enzymatic coagulation of milk. Fundamentals of Cheese Science. Eds.: Springer: New York. NY, USA. 2017. Chap. 7. P. 185-229.
8. González-Velázquez D.A., Mazorra-Manzano M.A., Martínez-Porchas M. et al. Exploring the milk-clotting and proteolytic activities in different tissues of Vallesia glabra: a new source of plant proteolytic enzymes // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2021. V. 193. P. 389-404.
9. Sbhatu D.B., Tekle H.T., Tesfamariam K.H. Ficus palmata ForskaL (BELES ADGI) as a source of milk clotting agent: a preliminary research // BMC Research Notes. 2020. V. 13. P. 446.
10. Мурашкин Д.Е., Беленькая С.В., Бондарь А.А. и др. Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO-K1) // Биохимия. 2023. Т. 88 (9). С. 1556-1569.
11. Akishev Z., Kiribayeva A., Mussakhmetov A. et al. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris // Heliyon. 2021. V. 7 (5). P. e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137
12. Belenkaya S.V., Elchaninov V.V., Shcherbakov D.N. Development of a producer of recombinant maral chimosine based on the Kluyveromyces lactis yeast // Biotekhnologiya. 2021. V. 37 (5). P. 20-27.
13. Беленькая С.В., Балабова Д.В., Белов А.Н. и др. Основные биохимические свойства рекомбинантных химозинов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. Т. 56 (4). С. 315-326.
14. Al-Zoreky N.S., Almathen F.S. Using recombinant camel chymosin to make white soft cheese from camel milk // Food Chemistry. 2021. V. 337. P. e127994.
15. Jensen J.L., Mølgaard A., Poulsen J.-C.N. et al. Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2013. V. 69. P. 901-913.
16. Obst U., Lu T.K., Sieber V. A modular toolkit for generating Pichia pastoris secretion libraries. ACS Synthetic Biology. 2017. V. 6. P. 1016-1025.
17. Patra P., Das M., Kundu P. et al. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts // Biotechnology Advances. 2021. V. 47. P. e107695.
18. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М. Получение промышленно важных ферментов на основе экспрессионной системы гриба Penicillium verruculosum // Биотехнология. 2020. Т. 36 (6). С. 17-34.
19. Saitua F., Torres P., Pérez-Correa J.R. et al. Dynamic genome-scale metabolic modeling of the yeast Pichia pastoris // BMC systems biology. 2017. V. 11. Iss. 1. Article 27. https://bmcsystbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12918-017-0408-2
20. Jungo C., Marison I., Von Stockar U. Mixed feeds of glycerol and methanol can improve the performance of Pichia pastoris cultures: A quantitative study based on concentration gradients in transient continuous cultures // Journal of Biotechnology. 2007. V. 128 (4). P. 824-837.
21. Мягконосов Д.С., Абрамов Д.В., Делицкая И.Н., Овчинникова Е.Г. Протеолитическая активность молокосвертывающих ферментов разного происхождения // Пищевые системы. 2022. Т. 5 (1). С. 47-54.
22. Акишев Ж.Д., Турсунбекова А.Е., Хасенов Б.Б. Молокосвертывающая рекомбинантного верблюжьего химозина // Exp. Biol. 2022. Т. 1 (90). С. 39-49.
23. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
24. Рудометов А.П., Беленькая С.В., Щербаков Д.Н. и др. Исследование ферментативной стабильности жидких препаратов рекомбинантного химозина коровы (Bos taurus taurus L) // Сыроделие и маслоделие. 2017. № 6. С. 40-43.
25. Warburg O., Christian W.Z. Isolierung und Kristallisation des Garungsterments Enolase // Biochemistry. 1942. V. 310. P. 384-421.
26. Ageitos J.M., Vallejo J.A., Sestelo A.B. et al. Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13 // Journal of Applied Microbiology. 2007. V. 103 (6). P. 2205-2213.