А.В. Соловьёв –
к.б.н., доцент, вед. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии; доцент, кафедра биологии и химии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова E-mail: solovyev_alexey@mail.ru
Е.И. Антонова –
д.б.н., профессор, кафедра биологии и химии, директор Научно-исследовательского центра
фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова
E-mail: antonov_67@mail.ru
А.В. Хамбикова – мл. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова E-mail: nastya010994@mail.ru
Р.М. Хузина – мл. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова
E-mail: hr.apple@ya.ru
Постановка проблемы. Искусственный синтез молекул ДНК, кодирующих целевой фермент, является необходимым для получения продуцентов рекомбинантных ферментов с оптимизированными свойствами и улучшенными техническими характеристиками микробиологического синтеза за счет оптимизации частот встречаемости кодонов и снабжения ДНК дополнительными функциональными последовательностями. Проблема прямого фосфорамидитного синтеза ДНК связана с крайне невысокой эффективностью синтеза длинных молекул ДНК (более 150 п.н.), в связи с чем возникает необходимость оптимизации технологий искусственного синтеза.
Цель работы – получение кДНК гена, кодирующего фермент химозин Bos taurus, на основе оптимизированного метода искусственного синтеза ДНК.
Результаты. Синтезированы три молекулы ДНК длиной 1193 п.н., 1155 п.н. и 1256 п.н., кодирующие фермент «химозин» с оптимизированными частотами кодонов и дополнительно снабженные разными функциональными последовательностями. Оптимизирована методика искусственного синтеза фрагментов ДНК длиной более 1000 п.н. Практическая значимость. Полученные искусственным путем фрагменты ДНК предназначены для последующей разработки продуцента химозина и микробиологического синтеза фермента. Разработанная и апробированная технологическая схема искусственного синтеза гена химозина может быть использована для синтеза других генов длиной более 1000 п.н.
- Emtage J.S., Angal S., Doel M.T., Harris T.J.R., Jenkins B., Lilley G., Lowe P.A. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli // Proceedings of the National Academy of Sciences // Biochemistry. 1983. V. 80. P. 3671–3675.
- Mellor J., Dobson M.J., Roberts N.A., Tuite M.F., Emtage J.S., White S., Lowe P.A., Patel T., Kingsman A.J., Kingsman S.M. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin is Saccharomyces cerevisiae // Gene. 1983. V. 24. P. 1–14.
- El-Sohaimy S.A., Hafez E.E, M.A. El-Saadani M.A. Cloning and In Vitro-Transcription of Chymosin Gene in E. coli // The Open Nutraceuticals Journal. 2010. V. 3. P. 63–68.
- Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites – a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis // Tetrahedron Letters. 1981. V. 22. P. 1859–1862.
- Reese C.B. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis // Organic and Biomolecular Chemistry. 2005. V. 3. № 21. P. 3851–3868.
- Cardoza R.E., Gutiérrez S., Ortega N., Colina A., Casqueiro J., Martin J.F. Expression of a Synthetic Copy of the Bovine Chymosin Gene in Aspergillus awamori From Constitutive and pH-Regulated Promoters and Secretion Using Two Different Pre-Pro Sequences // Biotechnology and Bioengineering. 2003. V. 83. P. 249–259.
- Hayden M.A., Mandecki W. Laboratory methods: gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides // DNA. 1988. V. 7. P. 571–577.
- Stemmer W.P., Crameri A., Ha K.D., Brennan T.M., Heyneker H.L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides // Gene. 1995. V. 164. P. 49–53.
- Choi J.H., Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli // Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. V. 64. P. 625–635.
- Hughes R.A., Miklos A.E., Ellington A.D. Gene Synthesis: Methods and Applications // Methods Enzymology. 2011. V. 498. P. 277–309.
- Zhang P., Ding Y., Liao W., Chen Q., Zhang H., Qi P., He T., Wang J., Deng S., Pan T., Ren H., Wei Pan W. A simple, universal, efficient PCR-based gene synthesis method: Sequential OE-PCR gene synthesis // Gene. 2013. V. 524 (2). P. 347–354.