А.В. Соловьёв – 

к.б.н., доцент, вед. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии; доцент, кафедра биологии и химии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова E-mail: solovyev_alexey@mail.ru

Е.И. Антонова –

д.б.н., профессор, кафедра биологии и химии, директор Научно-исследовательского центра 

фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова

E-mail: antonov_67@mail.ru

А.В. Хамбикова – мл. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр  фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова E-mail: nastya010994@mail.ru

Р.М. Хузина – мл. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии, Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова

E-mail: hr.apple@ya.ru

Постановка проблемы. Искусственный синтез молекул ДНК, кодирующих целевой фермент, является необходимым для получения продуцентов рекомбинантных ферментов с оптимизированными свойствами и улучшенными техническими характеристиками микробиологического синтеза за счет оптимизации частот встречаемости кодонов и снабжения ДНК дополнительными функциональными последовательностями. Проблема прямого фосфорамидитного синтеза ДНК связана с крайне невысокой эффективностью синтеза длинных молекул ДНК (более 150 п.н.), в связи с чем возникает необходимость оптимизации технологий искусственного синтеза. 

Цель работы – получение кДНК гена, кодирующего фермент химозин Bos taurus, на основе оптимизированного метода искусственного синтеза ДНК.

Результаты. Синтезированы три молекулы ДНК длиной 1193 п.н., 1155 п.н. и 1256 п.н., кодирующие фермент «химозин» с оптимизированными частотами кодонов и дополнительно снабженные разными функциональными последовательностями. Оптимизирована методика искусственного синтеза фрагментов ДНК длиной более 1000 п.н.

Практическая значимость. Полученные искусственным путем фрагменты ДНК предназначены для последующей разработки продуцента химозина и микробиологического синтеза фермента. Разработанная и апробированная технологическая схема искусственного синтеза гена химозина может быть использована для синтеза других генов длиной более 1000 п.н.

1. Emtage J.S., Angal S., Doel M.T., Harris T.J.R., Jenkins B., Lilley G., Lowe P.A. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli // Proceedings of the National Academy of Sciences // Biochemistry. 1983. V. 80. P. 3671–3675.
2. Mellor J., Dobson M.J., Roberts N.A., Tuite M.F., Emtage J.S., White S., Lowe P.A., Patel T., Kingsman A.J., Kingsman S.M. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin is Saccharomyces cerevisiae // Gene. 1983. V. 24. P. 1–14.
3. El-Sohaimy S.A., Hafez E.E, M.A. El-Saadani M.A. Cloning and In Vitro-Transcription of Chymosin Gene in E. coli // The Open Nutraceuticals Journal. 2010. V. 3. P. 63–68.
4. Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites – a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis // Tetrahedron Letters. 1981. V. 22. P. 1859–1862.
5. Reese C.B. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis // Organic and Biomolecular Chemistry. 2005. V. 3. № 21. P. 3851–3868.
6. Cardoza R.E., Gutiérrez S., Ortega N., Colina A., Casqueiro J., Martin J.F. Expression of a Synthetic Copy of the Bovine Chymosin Gene in Aspergillus awamori From Constitutive and pH-Regulated Promoters and Secretion Using Two Different Pre-Pro Sequences // Biotechnology and Bioengineering. 2003. V. 83. P. 249–259.
7. Hayden M.A., Mandecki W. Laboratory methods: gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides // DNA. 1988. V. 7.  P. 571–577.
8. Stemmer W.P., Crameri A., Ha K.D., Brennan T.M., Heyneker H.L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides // Gene. 1995. V. 164. P. 49–53.
9. Choi J.H., Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli // Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. V. 64. P. 625–635. 
10. Hughes R.A., Miklos A.E., Ellington A.D. Gene Synthesis: Methods and Applications // Methods Enzymology. 2011. V. 498. P. 277–309.
11. Zhang P., Ding Y., Liao W., Chen Q., Zhang H., Qi P., He T., Wang J., Deng S., Pan T., Ren H., Wei Pan W. A simple, universal, efficient PCR-based gene synthesis method: Sequential OE-PCR gene synthesis // Gene. 2013. V. 524 (2).  P. 347–354.