М.Г. Холявка - к.б.н., науч. сотрудник, кафедра биофизики и биотехнологии, Воронежский государственный университет. E-mail: holyavka@rambler.ru А.С. Беленова - к.б.н., мл. науч. сотрудник, кафедра фармацевтической химии и фармацевтической технологии, Воронежский государственный университет. E-mail: belenova@pharm.vsu.ru Е.Л. Макарова - аспирант, кафедра биофизики и биотехнологии, Воронежский государственный университет. E-mail: makarova7809@mail.ru Т.А. Ковалева - д.б.н., профессор, кафедра биофизики и биотехнологии, Воронежский государственный университет. E-mail: tamara_kovaleva@inbox.ru В.Г. Артюхов - д.б.н., профессор, зав. кафедрой биофизики и биотехнологии, Воронежский государственный университет

Обобщены результаты исследований (в том числе собственных) путей регулирования и стабилизации активности инулиназ, липаз и глюкоамилаз. Особое внимание уделено характеристике гетерогенных препаратов на основе иммобилизованных энзимов и путей их применения. Показано, что одним из эффективных механизмов регулирования и стабилизации активности фермента является его иммобилизация. Выдвинуто предположение, что механизмы стабилизации иммобилизованного энзима в условиях экстремальных значений pH, температуры, а также других денатурирующих агентов в главных чертах совпадают и обусловлены, прежде всего, изменением степени мобильности третичной структуры белка, ответственной за образование фермент-субстратного комплекса. Предложена схема процессов адсорбционной иммобилизации инулиназ, липаз и глюкоамилаз на ионитах и хитозане. Отмечено, что универсального метода иммобилизации гидролаз в настоящее время не существует, каждый из способов имеет свои преимущества и недостатки. В целом выбор метода иммобилизации биокатализатора зависит от задач исследования и направления использования получаемого ферментного препарата в той или иной области науки и производства.

1. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты // Биотехнология / под общ ред. А.А. Баева.М.: Наука. 1984. С. 93-103.
2. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы: В 2 т. / под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинек. М.: Изд-во МГУ. 1976. Т. 1. 296 с.
3. Кретович В. Введение в энзимологию. М.: Наука. 1986. 336 с.
4. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. Биотехнология. В 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа. 1987. 159 с.
5. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Таха А.С. Исследование иммобилизации инулиназы на ионогенных и неионогенных носителях // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. № 5. С. 804-810.
6. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Таха А.С. Разработка гетерогенного катализатора реакции гидролиза инулина на основе иммобилизованного препарата инулиназы из Kluyveromycesmarxianus// Биотехнология. 2007. № 3. С. 80-87.
7. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Битюцкая Л.А., Гречкина М.В. Термическая инактивация свободнойи иммобилизованной инулиназы // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 4. С. 422-427.
8. Kim W.Y., Byun M.S. Hydrolysis of inulinum from Jerusalem artichoke by inulase immobilized on aminoethylcellulose // Enzyme Microb. Technol. 1982. V. 4. № 2. P. 239-244.
9. Bajpai P., Margaritis A. Immobilization of K. marxianus cells containing activity in open pore gelatin matrix: application for high fructose syrup production // Enz. Microbiol. Technol. 1985. V. 7. P. 459-461.
10. Wei W., Wan W., Le H., Wang S. Continuous preparation offructose syrups from Jerusalem artichoke tuber using immobilizedintracellular inulinase from Kluyveromyces sp. Y-85 // Proc.Biochem. 1999. V. 34. P. 643-646.
11. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Таха А.С.Исследование некоторых параметров иммобилизованной инулиназы из Kluyveromycesmarxianus как перспективного катализатора реакции гидролиза инулина // Биотехнология. 2009. № 2. С. 55-59.
12. Singh R.S., Dhaliwal R., Puri M. Partial purification and characterization of exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1 for preparation of high-fructose syrup //J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 17. № 5. P. 733-738.
13. Kim B., Kim H., Nam S. Continuous production of fructose-syrups from inulin by immobilizedinulinase from recombinant Saccharomyces cerevisiae //Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997. V. 2. P. 90-93.
14. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Богданова С.С. Иммобилизация инулиназы различными методами на макропористых анионообменных смолах. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т. 148. № 7. С. 49-52.
15. Gupta A.K., Rathore P., Kaur N., Singh R. Production, thermal stability and immobilisation of inulinase from Fusarium oxysporum // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1990. V. 47. № 3. P. 245-257.
16. Letca D. Production of di-D-Fructofuranose 1,2´:2,3´ Dianhydride (DFA III) using Recombinant Inulase II: dissertation (Bukarest, 2004) (http://deposit.d-nb.de/cgi-bin/dokserv-idn= 970064837&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename= 970064837.pdf).
17. Letca D., Hemmerling C., Walter M., Wullbrandt D., Buchholz K.Immobilization of recombinat inulase II from a genetically modified Escherichia colistrain //Roum. Biotechnol. Lett. 2004. V. 9. № 5. P. 1879-1886.
18. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф., Григорьева Г.А.Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на амфотерных полиэлектролитах // Журнал физической химии. 2001. Т. 75. № 11. С. 2008-2010.
19. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф., Григорьева Г.А.Термоинактивация глюкоамилазы, иммобилизованной на амфотерных ионообменниках АНКБ-2 и АНКБ-35 // Журнал физической химии. 2001. Т. 75. № 12. С. 2290-2291.
20. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф., Григорьева Г.А. Зависимость термостабильности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы от концентрации ионов водорода // Журнал физической химии. 2001. Т. 75. № 12. С. 2292-2293.
21. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф. Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на неионогенном сорбенте Стиросорб // Журнал прикладной химии. 2001. Т. 74. № 5. С. 869-871.
22. Руадзе И.Д., Жеребцов Н.А., Слепокурова Ю.И., Селеменев В.Ф., Шкутина И.В., Стоянова О.Ф. Иммобилизация глюкоамилазы из Aspergillus awamori 466, некоторые свойства препарата // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 2. С. 202-208.
23. Коваленко Г.А., Комова О.В., Симаков A.B., Перминова JI.B., Хомов В.В., Боровцова О.Ю., Рудина H.A. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. II. Биокаталитические свойства адсорбированной глюкоамилазы // Биотехнология. 2002. № 5. С. 81-93.
24. Коваленко Г.А, Перминова Л.В., Терентьева Т.Г., Плаксин Г.В. Каталитические свойства глюкоамилазы, иммобилизованной на углеродном носителе сибуните // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43. № 4. С. 412-418.
25. Kovalenko G., Perminova L., Plaksin G., Chuenko T., Komova O., Rudina N. Immobilized glucoamylase: a biocatalyst of dextrin hydrolysis // Applied Biochemistry & Microbiology. 2006. V. 42. № 2. P. 145.
26. Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова А.С. / Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8. № 6. С. 1035-1041.
27. Aziz Tanriseven, Yıldız Bozkurt Uludag, Senay Dogan. A novel method for the immobilization of glucoamylase to produce glucose from maltodextrin // Enzyme and Microbial Technology. 2002. V. 30. P. 406-409.
28. Nenad B. Milosavić, Radivoje M. Prodanović, Slobodan M. Jovanović, Zoran M. Vujčić.Immobilization of glucoamylase on macroporous spheres //APTEFF. 2004. V. 35. P. 1-280.
29. Bayramoglu G., Altintas B., Arica M.Y. Immobilization of glucoamylase onto polyaniline-grafted magnetic hydrogel via adsorption and adsorption/cross-linking // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. № 3. P. 1149-1159.
30. Pereira E.B., Zanin G.M., Castro H.F. Immobilization and catalytic properties of lipase on chitosan for hydrolysis and esterification reactions // Brazilian Journal of Chemical Engineering. 2003. V. 20. №4. P. 343-355.
31. OhJ.M., Lee D.H., SongY.S., KimS.W., Lee S.G.Stability of Immobilized Lipase on Poly(vinyl alcohol) // J. Ind. Eng. Chem. 2007. V. 13. №. 3. P. 429-433.
32. Yilmaz E., Can K.,Sezgin M,Yilmaz M.Immobilization ofCandida rugosa lipase on glass beads for enantioselective hydrolysis of racemic Naproxen methyl ester // Bioresource Technology. 2011. V. 102. № 2. P. 499-506.
33. Krakowiak A., TrzciÄska M., Sieliwanowicz B., Sawicka-ûukowska R., Jadrychowska B., Ajzenberg V. Properties of immobilized and free lipase from Rhizopus cohnii. Polish journal of food and nutrition sciences // 2003. V. 12/53. № 3. P. 39-44.
34. Nawani N., Singh R., Kaur J.Immobilization and stability studies of a lipase from thermophilic Bacillussp.: The effect of process parameters on immobilization of enzyme //Electronic Journal of Biotechnology. 2006. V. 9. № 5 (http://www.ejbiotechnology.info/ content/vol9/issue5/full/9/index.html).
35. Knigh K., do Carmo Barros Pimentel M., de Morais M.M.C., Ledingham W.M., de Lima Filho J.L., de Mascena Diniz Maia M.Immobilization of lipase from Fusarium solani fs1 // Brazilian Journal of Microbiology. 2000. V. 31. № 3. P. 219-221.
36. Kharrat N., Ali Y.B., Marzouk S., Gargouri Y., Karra-ChâabouniM.Immobilization of Rhizopus oryzaelipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme // Process Biochemistry. 2011. V. 46. № 5. P. 1083-1089.
37. Shafei M.S., Allam R.F. Production and immobilization of partially purified lipase from Penicillium chrysogenum // Malaysian Journal of Microbiology. 2010. V. 6. № 2. P. 196-202.
38. StarkM.B., Holmberg K.Covalent immobilization of lipase in organic solvents // Biotechnol. Bioeng.1989. V. 5. № 34 (7). P. 942-950.
39. Mendes A.A., Freitas L., de Carvalho A. K. F., de Oliveira P. C., de CastroH. F. Immobilization of a commercial lipase from Penicillium camembertii (Lipase G) by different strategies // Enzyme Res.2011. P. 1-8.
40. Ковалева Т.А., Беленова А.С., Сливкин А.И., Лапенко В.Л.Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы // Биотехнология. 2010. № 4. С. 59-64.
41. Ковалева Т.А., Беленова А.С., Шаталов Г.В. Иммобилизация липазы на поли-N-винилпирролидоне // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 151. № 4. 395-397.
42. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф., Меркулова Ю.Д.Особенности адсорбции инулазы на волокнистых полиэлектролитах // Сорбционные и хроматографические процессы. 2004. Т. 4. № 4. С. 422-427.
43. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф. ИК-спектроскопия для исследования комплекса инулаза-носитель // Вестник ВГУ. Сер.: Химия, Биология, Фармация. 2004. № 1. С. 110-113.
44. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Лунина В.В. Влияние ионной формы полиамфолита АНКБ -2 на иммобилизацию ферментов //Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. Вып. 2. С. 247-253.